信帆生物推出：ky体育在线登陆HRP的製備方法

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1).水提取：稱取5kg用水衝(chong) 刷幹淨的鮮辣根(辣根皮中亦含有豐(feng) 富的HRP)，用菜刀切成小碎塊，在絞肉機中絞碎1～2次。碎渣漿用1倍體(ti) 積的水低溫下攪拌提取過一夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩幹機(或離心機)甩幹，收集濾液，碎渣再用1/4倍體(ti) 積水浸泡提取1次，合並2次濾液，測得總體(ti) 積。

2).硫酸銨分級分離：在不斷攪拌下，每1000mL濾液中慢慢加入226g硫酸銨粉末(相當於(yu) 0.40飽和度，0℃)，大約在1~2h內(nei) 加完，置冷室中放置過一夜。次日將上清液小心地用虹吸管移出，下麵混濁液以3 000r/min離心15min，棄沉澱，合並上清液。再按每1000mL上清液加258g硫酸銨粉末(0.8飽和度)隨加隨攪拌，當硫酸銨全部溶解後，置冷室過一夜。次日，虹吸出上清液，沉澱部分在冰凍離心機中以13000r/min離心20min，棄去上清液，收集沉澱。將沉澱懸浮於(yu) 100~150mL蒸餾水中(加水量要使沉澱全部溶解為(wei) 止)，分裝於(yu) 透析袋內(nei) ，放在流動自來水中進行透析1～2天，直到硫酸銨透析完畢為(wei) 止(可用5%乙酸鋇溶液或奈氏試劑進行檢查)。然後改換成用蒸餾水透析，中間更換2~3次，用0.1mol/L硝酸銀溶液檢查透析外液無氯離子為(wei) 止。將透析液合並，在冰凍離心機中以4 000r/min離心15min，棄去沉澱，量上清液的體(ti) 積。

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3).丙酮分級分離：將上清液倒入燒杯並置冰鹽浴中，在不斷攪拌下，用細滴管沿杯壁加入1倍體(ti) 積預冷至-15℃的丙酮，放置片刻，在冰凍離心機中以4000r/min離心15min，棄去沉澱。上清液再加入0.8體(ti) 積(按原上清液體(ti) 積)-15℃丙酮，(操作同上)，靜置後，在冰凍離心機中離心收集沉澱。將沉澱溶於(yu) 少量蒸餾水中，透析除去丙酮。可得RZ值近於(yu) 1的酶溶液。

4).精製：將上步酶液適當稀釋，滴加1mol/L硫酸鋅溶液，使酶液中鋅離子濃度為(wei) 10 -3 mol/L，5 000r/min離心10min，得上清液。再將沉澱用少量蒸餾水洗滌，離心，洗液與(yu) 清液合並，分裝於(yu) 透析袋內(nei) ，用水透析除鹽，用微孔濾膜過濾，進行真空冰凍幹燥(約得20mg)，產(chan) 品呈米黃色纖維狀鬆軟物，HRP產(chan) 品的RZ值可達3.0左右，置真空幹燥器中低溫保存。

(1)戊二醛二步法)

1) 原理：戊二醛為(wei) 一種雙功能試劑，通過其醛基分別與(yu) 酶和免疫球蛋白上的氨基共價(jia) 結合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物。

2)標記步驟：

(1) 稱取HRP25mg溶於(yu) 1.25%戊二醛溶液中，於(yu) 室溫靜置過一夜。

(2) 反應後的酶溶液經Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控製在1ml/1分鍾，收集棕色流出液。如體(ti) 積大於(yu) 5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。

(3) 將待標記的抗體(ti) 12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。

(4) 用1M PH9.5碳酸緩衝(chong) 液0.25ml，繼續攪拌3?小時。)

(5) 加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻後，置室溫2小時。

(6) 在攪拌下逐滴加入等體(ti) 積飽和硫酸銨，置4℃1小時。

(7) 3000rpm離心半小時，棄上清。沉澱物用半飽和硫酸銨洗二次，zui後沉澱物溶於(yu) 少量0.15M PH7.4的PBS中。

(8) 將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4的PB緩衝(chong) 鹽水透析，去除銨離子後(用萘氏試劑檢測)，10,000rpm離心30分鍾去除沉澱，上清液即為(wei) 酶結合物，分裝後，冰凍保存。

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