信帆生物為你分享：免疫組化與抗原修複技術的應用

信帆生物為(wei) 你分享：免疫組化與(yu) 抗原修複技術的應用

福爾馬林固定時，組織中的許多氨基酸殘基在分子內(nei) 或分子間形成了醛鍵，使得不少抗原決(jue) 定簇被封閉。同時，由於(yu) 甲醛的聚合作用，使蛋白質分子間相互交聯形成大分子網絡，也導致了抗原決(jue) 定簇被掩蓋，這就使得相當部分的抗原不能與(yu) 抗體(ti) 很好是進行反應。因此，抗原修複也是影響免疫組化染色結果的基本因素。抗原修複(Antigen retrieval ，AR)技術，建立在Fraenkel-conrat等人[1]一係列生物化學研究，經1991年shi等人[2]發展。抗原修複是指石蠟、冰凍、火棉膠、塑料切片免疫組織化學(IHC)前用胰蛋白酶、尿素、表麵活性劑、微波緩衝(chong) 液和金屬鹽等，使被掩蓋的抗原決(jue) 定簇或變性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢複過程。抗原修複能zui大程度地恢複在製片等過程中損失的抗原性，使原來認為(wei) 不能在石蠟切片上進行IHC的許多抗體(ti) 獲得了良好的染色結果，成為(wei) 一種有效的補救措施。本文的目的是概述AR-HIC的發展、應用和標準化。

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一、 AR技術

加熱AR技術

微波加熱方法. 在傳(chuan) 統標準方法,經脫蠟、脫水和用3%H2O2阻斷內(nei) 源性過氧(化)物酶，石蠟切片經蒸餾水衝(chong) 洗，放置在塑料Coplin缸中。加入AR液，如蒸餾水、緩衝(chong) 液、金屬鹽液、尿素等，蓋上並置家用微波爐加熱5或10分鍾(注意防止切片幹躁)。有時在加熱5分鍾後，間隔1分鍾，再加熱5分鍾(在*個(ge) 5分鍾後檢測液體(ti) 高度)。加熱後，從(cong) 微波爐取出塑料Coplin缸，冷卻15分鍾。片子經蒸餾水衝(chong) 洗二次後在PBS液中浸5分鍾，才進行IHC染色。為(wei) 了保持一致的加熱條件，必須設定靠近微波爐中心相同的位置及同一編號的Coplin缸 ，按照不同的抗體(ti) 設定不同的加熱時間，盡可能的建立標準的加熱條件。

微波(MW)加熱過程如下：在盒內(nei) 放入200ml檸檬酸緩衝(chong) 液(PH6.0±0.1)，並蓋上帶有小孔的蓋子，微波加熱至沸騰;將脫蠟水化後的組織切片置於(yu) 耐高溫塑料切片架中，放入已沸騰緩衝(chong) 液中，有作者提供做免疫組化時采用微波爐中等功率800W[3]，微波爐選用解凍檔的國產(chan) 家用微波爐(根據目前的研究,建議用醫用微波爐)，中檔繼續處理10-20分鍾;取出微波塑料缸冷卻至室溫，從(cong) 緩衝(chong) 液中取出玻片，片子經蒸餾水衝(chong) 洗二次，之後用PBS(PH7.2-7.4)衝(chong) 洗兩(liang) 次，每次3分鍾。

盡管有少數作者[4]認為(wei) 經高溫後冷卻這一步省略。在我們(men) 觀點，15分鍾的冷卻必須的幾點理由：1、如這一步省略，對於(yu) 有些抗體(ti) 而言，會(hui) 降低AR-IHC染色強度。2、突然從(cong) 高溫到低溫可導致組織片掉片。3、可能引起形態學的變化。

單純加熱方法. 將切片放入盛有檸檬酸緩衝(chong) 液的容器中,置電爐(600W)上加熱至沸騰，並持續10min 。Shi等人[2]用單純加熱方法與(yu) 微波加熱方法比較IHC染色強度，顯示兩(liang) 種方法導致相同的染色強度。

高壓加熱方法. Shin等人[5]發展了含水高壓鍋煮沸方法，來增強福爾馬林固定的腦組織tau蛋白免疫反應性。將切片連同檸檬酸緩衝(chong) 液放入高壓鍋內(nei) ，加熱至產(chan) 生噴氣，並持續2min，壓力鍋離開熱源，加熱長短的控製很重要，從(cong) 組織切片放入緩衝(chong) 液到高壓鍋到壓力鍋離開熱源總時間在5-8分鍾，時間過長可能會(hui) 使染色背景加深。現試劑公司提供的大多數抗體(ti) 都建議使用高壓鍋煮沸方法，這幾年的實踐表明，采取此方法可避免假陽、陰性，使IHC染色效果更佳。

非加熱AR技術

非加熱AR技術包括酶消化、酸水解等方法。目前，主要是酶消化，酶消化是以化學的方法來打斷醛鍵，修複抗原。

胰蛋白酶消化法.取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入100ml0.05%或0.1%PH7.8的無水氯化鈣水溶液中，溶解即可;或由邁新提供的0.125%的液體(ti) 胰酶。將切片放入濕盒內(nei) 37oC溫箱中消化18-20分鍾。

胃蛋白酶消化法 . 用0.1mol/L HCL配製成0.4%的胃蛋白酶;

鏈黴蛋白酶消化法 . 將鏈黴蛋白酶溶於(yu) 0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL中，濃度為(wei) o.1%，消化時間20min。

抗原修複的方法選擇，關(guan) 係到組織抗原能否暴露充分，這對免疫組化染色效果有很大影響。因此應當根據不同的抗原特點，采用不同的修複方法。對某些細胞內(nei) 抗原(如Fas、Bax、FⅧ等)和細胞間質抗原(如Laminin、CoIV等)則需要用酶消化法處理切片。常用的消化酶為(wei) 胰蛋白酶和胃蛋白酶。一般說來，胰蛋白酶消化能力較胃蛋白酶弱，主要用於(yu) 細胞內(nei) 抗原的消化，胃蛋白酶主要用於(yu) 細胞間抗原的消化。工作中要認真參照抗體(ti) 說明書(shu) 指示進行消化酶的選擇，這樣針對性更強，標記效果更理想。

總之,以高壓加熱方法、微波加熱方法較為(wei) 穩定, 高壓加熱方法效果優(you) 於(yu) 微波加熱方法和單純加熱方法。溶液的濃度對修複效果無任何影響，而PH值則影響較大。緩衝(chong) 液以檸檬酸緩衝(chong) 液和Tris-HCL較常用。前人的研究表明，溫度高修複時間短[6]。解放軍(jun) 第251醫院根據研究病理診斷、鑒別診斷和研究的實際需要，在抗原修複方法規範研究和應用的基礎上，創用了胰蛋白酶—尿素聯合消化技術、鹽酸水解暴露抗原技術和MW—表麵活性劑Triton X—100(MW—TX)修複抗原技術 [7] 。抗原暴露或抗原修複方法較多，其中發MW—枸櫞酸緩衝(chong) 液使用較多，效果。MW修複抗原的方法是石蠟切片脫蠟、水洗後放入修複液中，用250W的輸出功率2X5min，待冷卻至室溫按常規處理。目前AR過程已成功應用在BioTek全自動免疫組化染色儀(yi) 中。

二、AR應注意的問題

加熱持續時間和強度是重要的影響因素之一，AR液的PH值、濃度、化學成分也是重要的影響因素之一。使用低PH值AR液必須使用陰性對照片，以防止定位不準[9]。Shi等人[10]強調修複緩衝(chong) 液的PH值對某些抗原的修複十分重要,實驗中我們(men) 也發現要獲得滿意結果必須選擇抗原修複液的zui適PH值。在常規石蠟切片做AR-IHC，采用不同濃度的Alcl3液做AR液，發現4%的Alcl3取得的染色[11]。在修複的抗原中，金屬鹽可影響蛋白的結構。鄭輝等人[12]使用0.01mmol/LPBS、0.01mol/L檸檬酸緩衝(chong) 液、0.1mol/L Tris-HCL緩衝(chong) 液及1mmol/L EDTA-Na2，於(yu) 微波修複抗原，發現其陽性強度逐漸增強。

高溫抗原修複因其機理相當複雜，對某些存在的問題很難用設計對照的方法加以解決(jue) ，有些抗體(ti) 在冰凍切片上呈陰性反應，但在石蠟切片用抗原修複後卻能很好的顯示。對某些應表達在胞漿或表達在核內(nei) 的抗原，經過量修複後，絕大部分表達在核內(nei) ，例如，P185、Bcl-2、P-gp、Nm23，而有些表達在核內(nei) 的抗原經過量修複會(hui) 出現在胞漿內(nei) ，例如P53、PcNA、Ki-67等[6]。在使用該方法時一定小心，對結果的判斷也要客觀地作出分析，侯寧等人發現端粒酶逆轉錄酶(TRT)經過抗原修複與(yu) 不經過抗原修複，其染色效果明顯不同，後者的陽性率明顯高於(yu) 前者[8]。操作中還應注意如下問題：

1、熱處理後應注意自然冷卻。

2、熱處理時要防止切片幹燥。

3、應根據不同的抗體(ti) 選擇合適的抗原修複方法。

4、一批抗原的檢測其溫度和時間一定保持一致。

5、注意形態學結構的改變(一般經高溫修複後胞漿會(hui) 明顯的破壞，而對細胞核的影響較大，會(hui) 出現核破裂，蘇木素淡染等現象，而經酶水解的切片，其細胞漿破壞視消化時間而異，但核破壞較輕)。

6、如果在常用的緩衝(chong) 液中無法實現抗原修複，或經修複後抗原定位發生改變，可改用一些不常用的緩衝(chong) 液，或加一些螯合劑，如EDTA等可改善某些抗原的修複。

用於(yu) IHC消化的酶很多，所選酶的種類，使用的濃度，PH值，消化時間及溫度等均要視組織固定的不同，所檢測抗原的性質、組織類型的不同而異，應通過預實驗摸索確定。使用酶消化的原則：胰蛋白酶和蛋白酶K一般用於(yu) 細胞內(nei) 抗原，如Keratin，CEA，GFAP等。胃蛋白酶則主要用於(yu) 細胞間質抗原的檢測，如fibronectin，Laminin，各型膠原等。一般來言，消化時間和組織固定的長短呈正比。在用酶消化，熱修複後均不能獲得結果的前提下使用抗原修複與(yu) 酶消化結合的方法，有時會(hui) 取得較為(wei) 滿意的結果。一般蛋白酶K和微波相結合，但應注意，可能檢測的抗原無論何種性質均會(hui) 在核內(nei) 出現假陽性反應。

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